Imaging a catodoluminescenza di strutture cellulari marcate con complessi luminescenti di iridio o renio a temperature criogeniche

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 13432 (2022) Citare questo articolo

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Riportiamo per la prima volta l'uso di due agenti di imaging di cellule vive del gruppo dei complessi di metalli di transizione luminescenti (IRAZOLVE-MITO e REZOLVE-ER) come sonde catodoluminescenti. Questa prima dimostrazione sperimentale mostra l'applicazione di entrambe le sonde per l'identificazione di strutture cellulari su scala nanometrica e vicine allo stato nativo direttamente nel microscopio elettronico a scansione criogenica. Questo approccio può essere potenzialmente applicato ad approcci correlativi e multimodali e utilizzato per colpire regioni specifiche all'interno di campioni vetrificati a basse energie del fascio di elettroni.

La microscopia elettronica rivela strutture cellulari con dettagli incredibili; tuttavia, la localizzazione specifica delle strutture su scala nanometrica nel suo ambiente nativo criofissato è ancora agli inizi. Gli attuali approcci per localizzare le strutture a temperatura ambiente includono la marcatura immunologica e di affinità con oro e, meno spesso, la marcatura chimica1. Un'altra possibilità è l'incorporazione di etichette bioortogonali, tag geneticamente espressi o sonde fluorescenti, i cui rilevamenti sono correlati all'ultrastruttura nella stessa cellula (microscopia ottica ed elettronica correlativa) con microscopia a super risoluzione e microscopia a criofluorescenza2,3,4,5. Queste tecnologie di imaging, che hanno fatto rapidi progressi negli ultimi anni, forniscono progressi significativi nella comprensione del funzionamento delle molecole nel contesto strutturale.

Qui esploriamo l'uso delle sonde IRAZOLVE-MITO e REZOLVE-ER per l'imaging a catodoluminescenza (CL). CL è l'emissione di fotoni da un materiale in risposta all'eccitazione da parte di elettroni accelerati. Il rilevamento dell'emissione di CL da campioni biologici6,7, fluorofori organici8,9,10, proteine ​​e punti quantici di semiconduttori11 è estremamente impegnativo a causa dei segnali ottici a bassa intensità che sbiancano ulteriormente rapidamente sotto il fascio di elettroni accelerati a causa del danno strutturale del materiale biologico Materiale. Al contrario, i nanocristalli inorganici luminescenti (ad esempio, nanodiamanti o nanocristalli drogati con elementi di terre rare) hanno acquisito crescente importanza come sonde CL luminose e stabili con spettri di emissione ristretti12,13,14,15,16,17,18. I nanocristalli drogati con elementi di terre rare possono essere potenzialmente utili per la microscopia elettronica CL correlativa (multicolore). Nello specifico, i nanocristalli YVO4:Bi3+, Eu3+ e Y2O3:Tb3 sono stati rilevati simultaneamente con CL e BSE a basse tensioni di accelerazione degli elettroni (≤ 2 kV) all'interno delle cellule endoteliali vascolari umane in blocchi di resina epossidica utilizzando la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM )19. FIB-SEM è stato utilizzato per rilevare le particelle LaF3:Tb3+ all'interno dei compartimenti endocitici di cellule umane incorporate nella resina epossidica12. I nanocristalli (ad esempio, Y2O3∶Tb3+, Y2O3∶Eu3+, LaF3:Tb3+), che hanno un diametro di circa 10 nm, hanno mostrato una notevole resistenza del segnale CL contro l'esposizione del fascio di elettroni anche ad un'elevata tensione di accelerazione (80 keV, 2 nA , 100 ms/pixel). Hanno mantenuto l'intensità del CL superiore al 97% rispetto all'intensità iniziale per 1 minuto20.

Le sonde IRAZOLVE-MITO e REZOLVE-ER sono state progettate per l'imaging time-lapse21,22. REZOLVE-ER, chimicamente fac-[Re(CO)3(1,10-fenantrolina)(4-piridiltetrazolato)], si localizza specificamente sulla membrana nucleare e sul reticolo endoplasmatico e consente anche il rilevamento di eventi esocitotici sulla membrana plasmatica21. IRAZOLVE-MITO (iridio complessato con 2-fenilpiridina ciclometallata e il ligando 5-(5-(4-cianofen-1-il)pirid-2-il)tetrazolato) ha un'elevata specificità per i mitocondri nelle cellule vive e il suo spettro di emissione è compreso tra 505 e 625 nm22. Entrambe le sonde penetrano rapidamente nella membrana cellulare, hanno una bassa citotossicità, sono resistenti al fotosbiancamento e, a differenza dei fluorofori organici, hanno una lunga durata nello stato eccitato che varia da centinaia di nanosecondi a millisecondi23. La durata prolungata dello stato eccitato deriva dalla disposizione strutturale delle sonde e dalla natura della molteplicità della tripletta eccitata di Ir e Re21,22. I complessi di metalli di transizione consentono l'accesso a nuovi stati elettronici grazie alla presenza di centri metallici del blocco D. Ciò dà origine alle loro proprietà fotofisiche e fotochimiche uniche (elevata resistenza al fotosbiancamento, durata prolungata dello stato eccitato e bassa citotossicità su lunghi tempi di esposizione), rendendo queste sonde preziose per l'imaging di cellule vive a lungo termine23,24,25.